中東呼吸綜合征冠狀病毒感染的常規(guī)檢測方法是通過實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄PCR 反應(yīng)和測序鑒定。有適當(dāng)經(jīng)驗(yàn)和生物安全條件的實(shí)驗(yàn)室可以嘗試用細(xì)胞分離病毒檢測，但不屬于常規(guī)檢測，本指南中未包含病毒分離的步驟。此外，鑒于我國尚無中東呼吸綜合征冠狀病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株和血清學(xué)檢測試劑，此版技術(shù)指南暫不包括血清學(xué)檢測內(nèi)容。

    任何中東呼吸綜合征冠狀病毒的檢測都必須在適當(dāng)條件的實(shí)驗(yàn)室由經(jīng)過相關(guān)技術(shù)安全培訓(xùn)的人員進(jìn)行操作。

目前病毒核酸的檢測方法主要有檢測E 蛋白上游基因（upE）、ORF1b 基因和ORF1a 基因三種。這些方法均高度敏感，檢測ORF1b 基因的方法不如針對ORF1a 的方法敏感，但比其更加特異。另外，已確定了中東呼吸綜合征冠狀病毒基因組中位于RNA 依賴的RNA 聚合酶（RdRp）和衣殼蛋白（N）基因的幾個(gè)適合測序驗(yàn)證的靶序列。

     在實(shí)驗(yàn)室要確認(rèn)一個(gè)樣本為陽性，需要滿足以下兩個(gè)條件的其中

一個(gè)：

（一）至少兩種中東呼吸綜合征冠狀病毒特異性PCR 結(jié)果陽性；

（二）一種PCR 結(jié)果為陽性，另外一種PCR 產(chǎn)物序列測序，與已知序列相符。

     當(dāng)針對中東呼吸綜合征冠狀病毒的兩種不同的檢測方法結(jié)果不一致的時(shí)候，應(yīng)當(dāng)采用反轉(zhuǎn)錄PCR 擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序以確認(rèn)檢測結(jié)果。

     陰性結(jié)果也不能排除臨床病人的感染，一些因素可能產(chǎn)生假陰性，包括：樣本質(zhì)量差，比如口咽等部位的呼吸道樣本；樣本收集的過早或過晚；沒有正確的保存、運(yùn)輸和處理樣本；技術(shù)本身存在的原因，如；病毒變異，PCR 抑制等。

     當(dāng)PCR 檢測結(jié)果為陰性，但臨床表現(xiàn)和流行病學(xué)特點(diǎn)提示是中東

呼吸綜合征冠狀病毒感染時(shí)，可采用血清學(xué)方法進(jìn)行檢測。雙份血清

標(biāo)本能夠滿足血清學(xué)檢測的要求。

熒光定量PCR 方法檢測中東呼吸綜合征冠狀病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)操作程序

1、目的

  規(guī)范熒光定量PCR 方法檢測中東呼吸綜合征冠狀病毒核酸的工

作程序，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確可靠。

2、范圍

  適用于熒光定量PCR 方法檢測中東呼吸綜合征冠狀病毒核酸。

3、職責(zé)

檢測人員：負(fù)責(zé)按照本檢測細(xì)則對被檢樣本進(jìn)行檢測。

復(fù)核人員：負(fù)責(zé)對檢測操作是否規(guī)范以及檢測結(jié)果是否準(zhǔn)確進(jìn)行

復(fù)核。

部門負(fù)責(zé)人：負(fù)責(zé)對科室綜合管理和檢測報(bào)告的審核。

4、樣本接收和準(zhǔn)備

4.1 核對被檢樣本姓名、性別、年齡、編號(hào)及檢測項(xiàng)目等。

4.2 待檢樣本的狀態(tài)如有異常，需注明。

4.3 待檢樣本應(yīng)存放于-70℃。

5、本方法檢測項(xiàng)目為中東呼吸綜合征冠狀病毒核酸測定（熒光

定量PCR 方法）

6、檢測儀器設(shè)備和材料

6.1 熒光PCR 檢測儀（ABI7000 或相似性能產(chǎn)品）

6.2 計(jì)時(shí)器

6.3 德國VITLAB移液器（10μl，100μl，1000μl），準(zhǔn)確度±2%

6.4 微型振蕩器

6.5 一次性手套

6.6 含氯消毒劑

7、檢測環(huán)境條件

實(shí)驗(yàn)應(yīng)在20℃-25℃室溫中進(jìn)行。

8、診斷試劑和材料

8.1 引物和探針：

upE：

upE-Fwd 5’-GCAACGCGCGATTCAGTT-3’

upE-Rev 5’-GCCTCTACACGGGACCCATA-3’

upE-Prb 5’FAM-CTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTCG-TAMRA 3’

ORF1b：

ORF1b-Fwd 5’-TTCGATGTTGAGGGTGCTCAT-3’

ORF1b-Rev 5’-TCACACCAGTTGAAAATCCTAATTG-3’

ORF1b-Prb 5’FAM-CCCGTAATGCATGTGGCACCAATGT-TAMRA 3’

8.2 QIAamp Viral RNA mini kit

8.3 PCR 反應(yīng)管：96 孔PCR 反應(yīng)板和透明封膜或PCR 反應(yīng)管和透

明蓋。

8.4 DEPC 水

8.5 AgPath one-step RT-PCR kit

9、檢測原理

Taqman 熒光探針為一段特異性寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒

光基團(tuán)和一個(gè)淬滅基團(tuán)。探針完整時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光被淬滅基

團(tuán)吸收；而PCR 擴(kuò)增時(shí)，聚合酶的5’-3’外切酶活性將探針切斷，

使熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，發(fā)射熒光。每一分子的產(chǎn)物生成都伴隨

著一分子的熒光信號(hào)產(chǎn)生，通過對熒光信號(hào)累積的監(jiān)測實(shí)現(xiàn)對整個(gè)

PCR 過程的實(shí)時(shí)監(jiān)測。該方法由于靶序列由引物和探針雙重控制，特

異性好，假陽性低。

10、檢測步驟

10.1 病毒核酸（RNA）的制備：

10.1.1 樣本要求：咽拭子（或其他呼吸道樣本）；全血或血清。

10.2 準(zhǔn)備提取試劑（在使用前進(jìn)行）：

10.2.1 Buffer AVL 工作液的制備

將試劑盒提供的Buffer AVL 液1ml 加入到1 管凍干的Carrier

RNA 中, 混合均勻, 徹底溶解Carrier RNA。在第1 次使用前將溶解

的Carrier RNA 加入到1 瓶Buffer AVL 中, 制成Buffer AVL 工作液，

保存于2-8℃（穩(wěn)定性為48 個(gè)小時(shí)）。在2-8℃條件下, Buffer AVL/

Carrier RNA 混合物可能會(huì)析出沉淀, 可在使用前80℃溫育使之融

解。

10.2.2 Buffer AW1 工作液的制備

試劑盒中Buffer AW1 以濃縮液的狀態(tài)提供。第1 次使用前, 按

照試劑瓶上的說明向其中加入規(guī)定量的無水乙醇制備成工作液。

Buffer AW1 工作液在室溫條件下可穩(wěn)定保存1 年。

10.2.3 Buffer AW2 工作液的準(zhǔn)備

試劑盒中Buffer AW2 以濃縮液的狀態(tài)提供。第1 次使用前, 按

照試劑瓶上的說明向其中加入規(guī)定量的無水乙醇制備成工作液。

Buffer AW2 工作液在室溫條件下可穩(wěn)定保存1 年。

10.3 病毒核酸（RNA）提取步驟：

所有試劑在使用前應(yīng)平衡至室溫；所有離心步驟應(yīng)在室溫下進(jìn)

行。

10.3.1 取n＋1 個(gè)1.5ml 滅菌塑料離心管, 作好標(biāo)記。n=樣本數(shù)

10.3.2 每個(gè)塑料離心管加560ul Buffer AVL 工作液。

10.3.3 將140ul 待測樣本及對照樣本加到上述離心管中,振蕩

混勻15 秒, 室溫孵育10 分鐘。

10.3.4 短暫離心后加入560μl 無水乙醇, 振蕩混勻15 秒, 再

短暫離心。

10.3.5 取步驟10.3.4 得到的混合物630μl，加入到QIAamp RNA

提取柱中（帶有2ml 的集液管）, 蓋上管蓋，6000×g 離心1 分鐘。

10.3.6 更換新的集液管, 將10.3.4 剩余的樣本加入到QIAamp

RNA 提取柱中，蓋上管蓋，6000×g 離心1 分鐘。

10.3.7 更換新的集液管, 打開管蓋, 加入500ul Buffer AW1 工

作液，6000×g 離心1 分鐘。

10.3.8 更換新的集液管, 打開管蓋, 加入500ul Buffer AW2 工

作液，20000×g 離心3 分鐘。

10.3.9 更換新的集液管, 20000×g 離心1 分鐘。

10.3.10 將QIAamp RNA 提取柱置于新的1.5ml 離心管上, 小心

的打開管蓋, 加入60μ1 洗脫液Buffer AVE, 蓋上管蓋, 室溫條件

下孵育1 分鐘, 6000×g 離心1 分鐘, 收集濾出液, 做好標(biāo)記, 4℃

保存?zhèn)溆谩?/span>

10.4 熒光定量PCR 檢測：

10.4.1 熒光定量RT-PCR 反應(yīng)液的準(zhǔn)備：

每個(gè)待檢樣本反應(yīng)液的組成為：

2×RT-PCR buffer：12.5μl

25×RT-PCR enzyme mix：1μl

引物（5mM）：各1μl

探針（5mM）：0.5μl

Detection enchancer：1.67μl

加水至20μl

10.4.2 每反應(yīng)管中加入待檢核酸5μl，蓋緊管蓋或封好透明膜,

置于PCR 檢測儀上。

10.4.3 擴(kuò)增條件設(shè)定：

45℃,10min；95℃,10min；95℃,15s,60℃,1min,共40 循環(huán)。

10.4.4 儀器檢測通道選擇：

使用ABI7000 熒光PCR 檢測儀時(shí)選擇Fam 熒光信號(hào),收集設(shè)在

60℃。具體設(shè)置方法請參照各儀器使用說明書。

10.4.5 結(jié)果分析閾值設(shè)定：

使用ABI7000 熒光PCR 檢測儀進(jìn)行結(jié)果分析時(shí),基線（baseline）

取3-10 或6-15 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào),闕值設(shè)定原則以闕值線剛好超過

正常陰性對照品擴(kuò)增曲線的高點(diǎn),也可根據(jù)儀器噪音情況調(diào)整。

11、熒光定量RT-PCR 反應(yīng)系統(tǒng)的質(zhì)量控制：

反應(yīng)結(jié)果應(yīng)同時(shí)符合以下3 個(gè)條件，否則試驗(yàn)結(jié)果無效。

11.1 陰性對照：無擴(kuò)增, 為陰性。

11.2 強(qiáng)陽性對照：Ct 值<25。

11.3 臨界陽性對照：Ct 值<35。

12、結(jié)果判斷：

12.1 陰性: 無Ct 值或Ct 為40。

12.2 陽性：Ct 值<37, 可報(bào)告為陽性。

12.3 Ct 值在37-40 之間的樣本建議重做, 若重做結(jié)果Ct 值< 37，

該樣本判斷為陽性, 否則為陰性。